Широкая распространенность инфекционных заболеваний, появление новых форм и возвращение уже забытых вызывают необходимость совершенствования специфической лабораторной диагностики. Выявление этиологии заболевания и определение лекарственной устойчивости возбудителя помогают оперативно назначать адекватное лечение, избегать осложнений и, в конечном счете, снижать смертность.
Ильшат МУСТАФИН,
заведующий кафедрой биохимии КГМУ, профессор, д.м.н.
Традиционные методы лабораторной диагностики инфекций базируются на таких классических методах микробиологии, как микроскопия, культуральное исследование, и серологической диагностике - иммуноферментном анализе. Но у этих методов есть недостатки - большая длительность и трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной подготовки персонала, а также высокая стоимость.
Молекулярная биология сегодня располагает широким спектром новейших методик, направленных на выявление антигенов, ферментов, токсинов и нуклеиновых кислот возбудителя. Главенствующую же роль среди них играют методы исследований, направленных на обнаружение генетического материала возбудителей инфекций.
Сегодня генодиагностика заняла достойное место в клинической медицине. Наилучшим ее методом считается полимеразная цепная реакция (ПЦР) - осуществляемая in vitro специфическая амплификация (накопление) нуклеиновых кислот с применением синтетических праймеров. Основным преимуществом ПЦР является ее высокая чувствительность. С помощью этого метода можно диагностировать не только острые инфекции, сопровождающиеся присутствием в организме большого количества возбудителей, но и хронические, латентные инфекции, а также заболевания со стертой, нетипичной клинической картиной. Метод обладает высокой специфичностью, а также позволяет выявлять возбудителей в довольно короткие сроки. Для ПЦР-диагностики могут использоваться любые биологические жидкости, ткани и клетки. Перечень молекулярно-биологических методов в медицинской диагностике постоянно пополняется: гибридизация нуклеиновых кислот, специфическая, мультиплексная ПЦР, ПЦР широкого спектра, обратно-транскрипционная ПЦР, ПЦР в реальном времени, секвенирование ДНК.
В диагностике инфекционных заболеваний все активнее начинают применяться нанотехнологии. В частности, методы, реализуемые на базе атомно-силовых молекулярных детекторов, дают возможность визуализировать и идентифицировать белковые маркеры заболеваний с чувствительностью, на несколько порядков превышающей таковую при стандартных лабораторных исследованиях.
Использование наночастиц позволяет определять инфекционные агенты в малом объеме пробы напрямую, эта методика дешевле традиционных, дает возможность проводить современную мультиплексную диагностику в сжатые сроки.
Метод спектроскопии, основанный на SERS (комбинационном рассеянии света) с использованием серебряных наночастиц, усиливающих сигнал, разработан для быстрого выявления следовых уровней вирусов. Метод обеспечивает быструю (менее 60 сек.) диагностику репродуцирующихся вирусов без дополнительных манипуляций, выявляя спектральные различия между различными штаммами.
Для детекции химических или биологических материалов могут быть использованы нанобиосенсоры, обладающие исключительной чувствительностью. Недавно предложенная технология Cantilever - одна из наиболее перспективных. Нанокантилеверы важны для создания нового класса ультрамалых сенсоров, используемых для детекции патогенов, обеспечивая постоянный мониторинг клинических параметров в режиме реального времени. Нанотехнологии в чипе - это система полного химического анализа, позволяющая осуществлять диагностику в ручном режиме. Пока количество подобных образцов не очень велико, но оно быстро растет. В нашей стране разработаны и производятся биочипы для диагностики туберкулеза и выявления устойчивости микобактерий к антибиотикам.
В настоящее время и в России, и за рубежом активно развиваются новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний, использующие методы протеомики - области современной биологии, занимающейся инвентаризацией белков живых организмов, изучением их экспрессии и взаимодействия в клетке. Использование знаний о геноме и протеоме микроорганизма в совокупности с высокопроизводительным аналитическим инструментом - масс-спектрометрическим анализом белков - открывает новые возможности для решения задач молекулярной диагностики инфекционных заболеваний.
Масс-спектрометрия - физический метод измерения массы ионов исследуемого вещества и их относительных количеств в смесях, использующий их разделение в вакууме под действием электрических и магнитных полей. Возможность получения специфичных для конкретного вида микроорганизмов масс-спектров белков позволяет быстро идентифицировать возбудителей заболеваний. Использование лазерной ионизации в комплексе с масс-спектрометрией стало настоящим прорывом в исследовании биоорганических молекул. Метод позволяет анализировать белковую фракцию микробной клетки и получать уникальные для данного вида масс-спектры, характеризующие объект по типу отпечатков пальцев. Особенностями подхода являются высокая чувствительность, скорость анализа и низкая стоимость используемых реактивов.
Концентрационный барьер для обнаружения и идентификации белковых молекул в биологическом материале, существующий в настоящее время в протеомике, составляет 10-10 M. При этом методы радиоиммунного и иммуноферментного анализа имеют предел чувствительности порядка 10-12 М. С другой стороны, концентрационные уровни белка в биологическом материале, особенно в плазме крови, находятся в очень широком диапазоне - от 10-3 М до единичных молекул. И современные диагностические приборы просто не «видят» низкокопийные тканевые белки в крови, сигнализирующие о начале заболевания или изменении состояния организма. Регистрировать белки - маркеры заболеваний - можно, используя молекулярные детекторы, «считающие» единичные молекулы.
Когда нет возможности увеличить количество молекул белка и получить большой объем биоматериала от пациента, одним из способов выделения белков из сложных смесей (например, плазмы крови) является их селективный захват на поверхности нанобиочипов за счет биоспецифических межмолекулярных взаимодействий (Archakov et al., 2006). Такой подход позволяет выделять из биологической жидкости белки с низким содержанием и концентрировать их с последующей идентификацией с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).
Атомно-силовая микроскопия позволяет визуализировать и подсчитывать как отдельные белковые молекулы, так и их комплексы. Острие зонда АСМ сканирует поверхность образца, а в качестве подложки используются атомарно-гладкие поверхности. При этом регистрируется сила взаимодействия между острием зонда кантеливера, укрепленного на пьезоэлектрическом кристалле, и поверхностью атомарно-гладкой подложки. Наблюдаемые изменения соответствуют топографии макромолекулы. Регистрирующая система позволяет детектировать вертикальное и латеральное смещение кантилевера одновременно. Когда игла взаимодействует с поверхностью молекулы, амплитуда колебаний изменяется. Это изменение соответствует топографии макромолекулы или комплекса молекул.
АСМ-технологии позволяют визуализировать белки в условиях, близких к нативным, то есть в природном состоянии. С помощью АСМ удалось визуализировать широкий спектр водорастворимых белков. Была продемонстрирована возможность использования АСМ для регистрации иммунокомплексов антиген/антитело, ряда белковых комплексов. В работах отечественных исследователей (Арчаков А.И. и соавт., 2010) были получены АСМ-изображения диагностических маркеров болезни Альцгеймера, гепатитов
В и С в сыворотке крови, вирусных частиц гепатитов В и С с помощью антигенов, иммобилизированных на наночипе. Эти объекты имеют размер от 2 до 40 нм, и их можно подсчитать!
Проблему низких концентраций биомолекул позволяют решать молекулярные детекторы, созданные на основе нанопроводов. Они имеют толщину в несколько атомов, располагаются на тончайшей платформе между электродами, образующими нанотранзистор. На их поверхность наносятся белки-рецепторы, способные специфически связываться с биологическими макромолекулами. В результате этого взаимодействия изменяется электрическая проводимость нанопровода, что сигнализирует о выявлении определенной субстанции. В 2004 году в лаборатории Чарльза Либера (Кембридж, Массачусетс) был создан сенсор на основе нанопроводов, позволяющий детектировать даже единичную вирусную частицу. Для одновременной регистрации вирусов нескольких видов нанопровод покрывают соответствующими антителами, при этом характер ответа при связывании разных вирусов индивидуален. Разработка молекулярного детектора с использованием нанопроводов применима для регистрации единичных клеток-маркеров инфекционных и соматических заболеваний, а также единичных вирусов гепатитов В и С (Институт биомедицинской химии РАМН совместно с Институтом физики полупроводников СО РАН, 2006).
Наиболее широкое применение в медицине нашли оптические биосенсоры - новые аналитические устройства, использующие биологический материал для «узнавания» молекул и дающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. К оптическим биосенсорам относятся конструкции, использующие эффекты поверхностного плазмонного резонанса (Sigmundsson et al., 2002) и резонансного зеркала (Cush et al., 1993), позволяющие в течение нескольких секунд регистрировать образование комплексов макромолекул с высокой концентрационной чувствительностью (до 10-12 M). Формирование комплексов вызывает увеличение индекса преломления света в чувствительном слое на сенсорной поверхности, что, в свою очередь, вызывает изменение сигнала.
Прослеживается тенденция по созданию многоканальных биосенсоров, например, SРR-биосенсор (Biocor, Швеция), позволяющих регистрировать сразу до 400 реакций комплексообразования в реальном времени. В России разработана биосенсорная система регистрации маркеров социально значимых заболеваний (Ivanov et al., 2006), в частности, гепатитов В и С в режиме реального времени без использования меток. Биосенсором с иммобилизованными на подложке антителами анти-НВs выявляется поверхностный антиген вируса гепатита В НВsАg в сыворотке пациентов по изменению индекса преломления света. Чувствительность измерений составила 10-9 М. Преимуществами этого метода диагностики являются быстрота анализа (5 - 8 мин.) и возможность многократного использования (до 100 - 150 раз) биочипа, что существенно снижает стоимость анализа.
По мнению Чарльза Либера, будущее в медицинской диагностике - за нанотехнологиями, обеспечивающими высокочувствительное и специфичное выявление белков, вирусов или ДНК в биологическом материале за считанные минуты.
